Вирусы. Драйверы эволюции. Друзья или враги?

Индукция профага и устойчивость к антибиотикам

Мутации, происходящие в результате ошибок при репликации хромосомной ДНК, случаются у бактерий часто благодаря быстрой смене поколений и являются источником генетической вариабельности – движущей силы адаптивной эволюции. Мутации – это чаще всего дискретные изменения в нуклеотидной последовательности хромосомной ДНК, которые влияют на функцию единичного гена или белка. Лишь очень редко хромосомные мутации улучшают функции бактериальной клетки и становятся объектом положительного отбора. Можно обоснованно утверждать, что наибольший вклад в эволюцию бактерий вносит приобретение (или потеря) последовательностей ДНК в ходе горизонтального переноса генов. Приобретаются целые гены или кластеры генов, что мгновенно дает бактериальной клетке потенциальные адаптивные признаки. Островки патогенности, присутствующие в вирулентных штаммах стафилококка, являются наиболее мощными переносчиками при горизонтальной передаче генов. Присутствующие в них гены привносят в клетку-реципиент ценные функции, так как кодируют белки, определяющие устойчивость к антибиотикам или повышенную патогенность. За эту валюту островки патогенности покупают преимущества, связанные с положительным влиянием естественного отбора на геном клеток-хозяев. Улучшение репликативной функции клетки-хозяина приносит пользу самому хозяину и его островкам патогенности. В ходе своего развития островки патогенности стали напоминать дефектные лизогенные фаги, зависящие от репликации хелперного фага для завершения своего репликационного цикла и инфицирования других клеток. Следовательно, мобилизация островка патогенности может быть запущена либо инфицированием клетки хелперным фагом, либо индукцией профага. Жестокая ирония судьбы заключается в том, что лечение, которое мы проводим для борьбы с бактериальными инфекциями, само стимулирует опосредуемую фагом трансдукцию ДНК, передачу островков патогенности другим клеткам и конверсию фагов (Modi et al., 2005). Наше лечение способствует усилению горизонтального переноса генов и закладывает фундамент под ускорение адаптивной эволюции тех самых возбудителей, против которых мы боремся.

Сегодня это повод для большой озабоченности. Наша система здравоохранения все чаще обнаруживает, что лечение опасных и угрожающих жизни бактериальных инфекций оказывается неэффективным вследствие развития устойчивости к антибиотикам. Открытие антибиотиков и их польза для человечества стали одним из величайших достижений медицинской науки, но сегодня почва уходит у нас из-под ног. В структуре смертности от инфекционных поражений среди госпитализированных больных в странах Европы и Северной Америки в девяностые годы первенствовали больные с приобретенным иммунодефицитом (зараженные ВИЧ-1); причиной смерти прежде всего становилась оппортунистическая инфекция. Сегодня в этой статистике не упоминаются больные СПИДом, но большая часть смертей обусловлена патогенной бактериальной инфекцией. В недалеком прошлом многие из этих инфекций были легко излечимы. Теперь же мы сталкиваемся с новыми штаммами бактерий, вооруженных способностью противостоять нашим самым мощным антибиотикам. Кризис, вызванный вирулентными, полирезистентными патогенными микроорганизмами, оказался таким угрожающим, что международные сообщества врачей-инфекционистов и специалистов-микробиологов затрубили тревогу, призывая правительства предпринять меры по стимуляции исследований в области борьбы с бактериальными инфекциями (Stagnates, 2004).

Тревожное положение дел обусловлено горизонтальным переносом генов между бактериями разных видов в нашем микробиоме, в окружающей среде и среди патогенных видов бактерий (Wright, 2007; Martinez, 2009; Penades et al., 2015). Избыточное назначение антибиотиков и их неумеренное применение при вскармливании скота внесли весомый вклад в возникновение резистентности к антибиотикам и множеству других лекарств у наших бактерий-комменсалов (Martinez, 2009). Однако даже метагеномы нетронутых уголков природы нагружены генетической информацией, которая готова вмешаться в эволюцию патогенности и устойчивости к антибиотикам (Colomer-Lluch, Jofre, Muniesa, 2011; Wright, 2007). Мобильные генетические элементы, в частности плазмиды, и, определенно, в некоторых случаях опосредованная фагом трансдукция – все это играет роль в мигрирующей резистентности к лекарствам и вирулентности генов среди комменсалов и изначально патогенных бактерий. Мы живем бок о бок с нашими кишечными микробиомами, и их запас мобильной патогенности и мобильной резистентности к антибиотикам должен особенно нас тревожить. Индукция фага внутри непатогенной симбиотической клетки нашего микробиома является главным феноменом, отвечающим за мобилизацию патологических генов. Эта концепция получила подтверждение в недавно опубликованной работе, выполненной в лабораториях, руководимых доктором Джеймсом Коллинзом в Бостонском университете и на медицинском факультете Гарвардского университета (Modi et al., 2013), в которой рассмотрены механизмы, лежащие в основе переноса резистентности к антибиотикам между бактериями, в норме обитающими в нашем кишечнике.

Известно, что такие стрессовые факторы окружающей среды, как антибиотики, даже в субтерапевтических дозах, которые намного ниже тех, которые назначают для лечения инфекций, могут провоцировать индукцию профагов в кишечных бактериях (Maiques et al., 2006; Ubeda et al., 2005). Нормальное, но редкое стохастическое событие становится частым и определяющим для бактериальной популяции. Исследовательская группа Коллинза попыталась воссоздать условия, возникающие на фоне лечения антибиотиками, использовав в качестве модели мышь. Ученые исследовали нарушения в фагеоме (совокупность последовательностей всех фаговых геномов в образце) в кале мышей, которые получали антимикробные препараты. Используя дозы антибиотиков, эквивалентные тем, что получают люди в процессе лечения инфекционных заболеваний, они выбрали два широко распространенных антибиотика с различными механизмами действия. Первый антибиотик – ципрофлоксацин из группы фторхинолонов, который подавляет микробную флору на уровне репликации ДНК, угнетая лигазную активность бактериального фермента топоизомеразы II. Как уже было сказано выше, введение фторхинолонов вызывает стрессовый SOS-ответ и индукцию фагов в патогенных энтерогемморагических кишечных палочках. Вторым антибиотиком был ампициллин – бета-лактам, который подавляет синтез вещества клеточной стенки бактерий. После лечения антибиотиками из кала мышей выделяли фаговую ДНК и методами глубокого секвенирования определяли фагеом. С помощью компьютерной программы сравнили эти данные с известными ДНК-последовательностями, что позволило определить их происхождение (бактериальное или фаговое), а также функцию соответствующих генов.

Результаты оказались поразительными, а выводы авторов имели огромное значение для нашего понимания ключевой роли фагов в генетическом разнообразии, а также их роли катализаторов генетической адаптации в микробиомах кишечника. У мышей, получавших антибиотики, как получают их больные с инфекциями, наблюдали увеличение количества фаговой ДНК, кодирующей широкий диапазон генных последовательностей, определяющих лекарственную резистентность. К удивлению ученых, однако, эти мобилизованные фаговые гены включали гены, ответственные за резистентность к вводимым антибиотикам, а также гены, связанные с резистентностью ко многим антибиотикам других групп. Эта полная трансдукция ДНК значительно обогатила генетическую сложность фагеома. Эта сложность возникла в результате мобилизации бактериальной ДНК из самых многочисленных родов бактерий, обитающих в кишечнике мышей. Кроме того, трансдукция обогатила пул бактериальных генов, которые обеспечивают выживание в условиях стресса. Например, фагеом мышей, получавших фторхинолон, обогатился генами, отвечающими за репликацию и репарацию ДНК, в то время как фагеом мышей, получавших ампициллин, обогатился генами, отвечающими за включение полисахаридов в клеточную стенку и за белки, катализирующие ее синтез, то есть за процессы, которые нарушаются на фоне приема ампициллина. Индукция фагов и полная трансдукция последовательностей бактериальной ДНК благоприятствуют генам, которые придают бактериям адаптивную способность переносить стрессовые ситуации. Исследователи также выявили фрагменты ДНК, содержащие фаговые и бактериальные последовательности, соединенные в одну крупную молекулу. Эти фрагменты ДНК свидетельствуют об инфекции и рекомбинации между геномами частицы фага и бактерии. Примечательно, что были обнаружены рекомбинантные ДНК, происходящие из фага и бактерии, что говорит о том, что – и это было неожиданностью – имеют место инновационные взаимодействия между клеткой-хозяином и фагом. Представляется, что в подвергнутой воздействию стресса экосистеме кишечника фаги не только выполняют функцию адаптивного генного банка, но и обеспечивают облегченный доступ к этому генетическому инвентарю, упрощая взаимодействие фага и клетки-хозяина.

Влияние фагов на эволюцию, усиление вирулентности и формирование полирезистентности, как выяснилось, усиливается в условиях воздействия антибиотиков на кишечную микрофлору. Дестабилизирующий эффект введения антибиотиков на кишечный микробиом повышает вероятность колонизации микроорганизмами новых ниш и расширения присутствия патогенных микробов в кишечной экосистеме. Такая дестабилизация нормальной флоры нашего кишечника является главной причиной патологического размножения таких оппортунистических микроорганизмов, как Clostridium difficile, которые в обычных условиях ничем себя не проявляют (Young, Schmidt, 2004; Owens et al., 2008). Работа Коллинза показывает, что антибиотики, таким образом, провоцируют непредсказуемые изменения в экосистеме нашего кишечника. Беспорядочная, хаотичная, опосредованная фагами мобилизация генов резистентности и вирулентности в микробиоме кишечника является весьма полезным открытием. Эта мобилизация потенциально способна ускорить микробную эволюцию и возникновение адаптивных патогенных вариантов с новой вирулентностью и новыми фенотипическими проявлениями резистентности.

Пассивным помощником патогенных бактерий является, без сомнения, огромный массив генетической информации, доступной для вирусного и бактериального метагеномов. Совокупно они действуют как резервуар генетической адаптации, стимулируемой и подстегиваемой репликацией, опосредуемой фагами. Этот набор генетической информации может быть мобилизован и использован для адаптивной эволюции. Роль горизонтального переноса генов в бактериальной эволюции так важна, что именно он является первичным и главным движителем расхождения видов, а часто и главным фактором микробного видообразования. Несомненно, бактериальные виды должны иметь совокупность генов, которые составляют ядерную специфичность данного вида, но границы этого ядра стерты почти неограниченным поступлением дополнительной мобильной генетической информации. Собирательное название всей этой огромной совокупности – микробный пангеном.

Все инфекции, будь то скарлатина, холера, дифтерия, синдром токсического шока, некротический фасциит или недавно обнаруженная инфекция устойчивыми к метициллину золотистыми стафилококками, являются закулисными кукловодами для мобильной генетической информации и опосредованных фагами биологических событий. Клинические руководства и органы общественного здравоохранения должны учитывать роль фагов и горизонтальной передачи генов в быстром возникновении и распространении устойчивых к антибиотикам высоковирулентных микроорганизмов. Мы проявим благоразумие, если усилим бдительность в отношении вирусов и разработаем такие лечебные схемы, которые позволят избежать стимуляции механизмов адаптивной эволюции возбудителей болезней, с которыми мы боремся.

Глава 4
Вирусы и высшие организмы

Теперь мы обратим внимание на наши собственные вирусы, на вирусы, составляющие человеческий виром. Мы находимся в разных отношениях с разными вирусами, сформированных различной длительностью совместной эволюции. Вирусная инфекция может быть преходящей и безвредной, а может и угрожать жизни. Вирусы могут вызывать хроническую инфекцию, при которой болезнь прогрессирует или протекает латентно с рецидивами. Многие вирусные инфекции протекают бессимптомно. Установлено, что каждый из нас постоянно инфицирован 8–12 вирусами (Virgin, 2014). Это число меняется с возрастом, с условиями окружающей нас среды, нашим финансовым положением и, самое главное, нашим геномом, а в особенности теми генами, которые управляют нашим иммунитетом. Эти оценки, несомненно, занижены, так как в расчет принимаются только вирусы нашего микробиома (главы 2 и 3); при этом невозможно учесть еще не выявленные вирусы.

Вирусы, клетки, организмы и популяции

Вирусы примитивных прокариот вступают в весьма развитые и богатые нюансами отношения со своими одноклеточными микробными хозяевами. Наше восприятие их как «примитивных» вводит в заблуждение: они эволюционировали вместе со своими хозяевами до появления третьего царства жизни – эукариот. Мы можем сколько угодно думать, будто наш видовой успех измеряется нашей биологической сложностью и культурной изощренностью – нашим разумом, развитием языка и культурными достижениями, но наш геном (и, если уж на то пошло, каждый наш ген) мало задумывается о таких вещах. Если бы он вообще умел думать, то считал бы успехом лишь возможность своего размножения и распространения. В этом отношении фаги и их геномы весьма и весьма успешны, так как сумели провести стадо своих генов через перипетии эволюции от времен зарождения жизни до нашего времени. Тем не менее сейчас мы ступим на территорию вирусов, инфицирующих нас с вами – позвоночных животных, многоклеточные организмы, представителей царства эукариот. Независимо от понимания успеха на генетическом уровне, этим микроскопическим машинам пришлось проложить очень сложный маршрут и проделать тернистый путь для того, чтобы сохранить и приумножить свои гены в эукариотических клетках.

В то время как вид Homo sapiens появился не более двухсот тысяч лет назад, многие инфицирующие нас вирусы, вероятно, были постоянными спутниками предков, от которых произошел человек разумный. Вирусы развивались, эволюционировали и следовали за ветвящимися и вновь образующимися видами по пути, ведущему от крупных обезьян до человека. Другие, не менее древние вирусы недавно нашли в человеке подходящую нишу и подарили ему новые заболевания. Точно так же, как мы, думающие о себе как о венце эволюции, вирусы выработали сложный стиль жизни, позволивший им с гарантией распространять их генетические линии, сохраняя идентичность на протяжении сотен тысяч и миллионов лет. Тот срез вирусов, который мы сейчас наблюдаем в нашем вироме, фиксирует лишь успешные линии вирусной информации, то есть те вирусы, которые обрели информационное содержание, позволяющее существовать им как видам. Особенность (и мы еще вернемся к ней позже) заключается в том, что в отличие от живых организмов вирусы не оставили после себя никаких ископаемых остатков, которые можно было бы соотнести с геологической хронологией. Все наши знания об эволюции вирусов основаны на ретроспективных суждениях, выведенных из генетического состава существующих в настоящее время вирусов. Исчезнувшие вирусы и их генетическая информация совершенно недоступны исследованию. Будучи эгоистичными генетическими паразитами, эти вирусы, если бы они обладали движущими мотивами своих действий, ничем бы не отличались в этом отношении от фагов, инфицирующих бактерии: их мотив – поддержание репликации. Параметры, которые влияют на успешность эукариотических вирусов, тоже не отличаются особой оригинальностью. Мы увидим, что и на таком высоком уровне факторы, направляющие эволюцию человеческих вирусов, работают так же, как и на уровне простейших фагов.

Однако с самого начала надо отметить одну значительную разницу. Она заключается в огромной сложности хозяина: это организм, кооперативное сообщество клеток. Когда мы обсуждали литические фаги, вирусы, инфицирующие бактерии и простейших, мы принимали в расчет только индивидуальные инфицированные бактериальные клетки. Успешное инфицирование фагом популяции бактериальных клеток начинается с проникновения в единичную клетку и реализуется после высвобождения дочерних фаговых частиц во внешнюю среду, где эти частицы могут беспрепятственно инфицировать других индивидов – другие бактериальные клетки. Эти частицы являются носителями генетической информации фага, отвечающими за передачу информации другим хозяевам. Отдельные, генетически идентичные клетки-хозяева, входящие в популяцию, инфицируются в ходе последовательных, разрастающихся по экспоненциальному закону циклов вирусной репликации до тех пор, пока сохраняется популяция клеток-хозяев. Успешные переходы из клетки в клетку являются важнейшим условием для репликации и распространения вирусов в популяции клеток-хозяев. Фаги бактериальных клеток приняли на вооружение разнообразные стратегии, обеспечивающие успешное размножение штаммов. Вирулентная литическая инфекция приводит к немедленной амплификации генома, в то время как лизогения отсрочивает продуктивную репликацию до более поздней реактивации профага. В каждом случае – я сейчас придерживаюсь данного мною определения вируса – необходимо, чтобы вирус был независимо развивающейся эгоистичной генетической единицей. Квинтэссенция «вирусности» заключается в передаче и инфицировании новых клеток-хозяев. Перед вирусами, инфицирующими многоклеточные организмы, стоит, в принципе, та же нелегкая фундаментальная задача обеспечения выживания – передача в новые клетки. Они должны инфицировать организм, реплицироваться и покинуть клетку с тем, чтобы проникнуть в новые клетки-хозяева. Это грандиозная и уникальная задача: вирусы должны отыскать доступ и сориентироваться в массиве из приблизительно 50 триллионов клеток, которые в сумме составляют наши ткани и органы. Вирусы должны отыскать именно те клетки, в которых могут реплицироваться, а также суметь уцелеть, несмотря на множество линий обороны организма. Позвоночные, например, обладают высокоразвитыми врожденными и адаптивными иммунными системами, призванными защищать организм от проникновения чужеродной генетической информации. И, наконец, вирусы должны иметь способ высвобождения дочерних вирусных частиц для их последующей передачи в другие клетки.

Даже для таких животных, как мы с вами, вирусную инфекцию и заболевания, вызываемые ею, можно свести к фундаментальным единицам, к инфицированию одной, отдельно взятой клетки. Тем не менее вирусы животных должны сделать многое сверх репликации и распространения внутри гетерогенной популяции клеток, составляющих ткани и органы нашего тела. Мало того, вирусы должны репродуцироваться и распространяться внутри популяции организмов, которые удалены друг от друга в пространстве. Различие в проявлениях разных вирусных инфекций представляют собой окно, через которое мы можем наблюдать механизмы и процессы, помогающие вирусам справляться с этими вызовами и успешно преодолевать давление естественного отбора, сохраняя свои штаммы на протяжении веков. Виромы животных состоят из совокупности более или менее патогенных вирусов, которые выработали разнообразные и порой удивительные стратегии в своих взаимоотношениях с хозяином. Отношения вирусов животных и их хозяев столь же разнообразны, как отношения фагов и прокариот, и представляют собой континуум, простирающийся от чистого паразитизма до взаимовыгодного симбиоза. Эти отношения вируса с хозяином являются результатом реципрокного хода эволюции хозяина и патогенного возбудителя, где, как в гонке вооружений, каждая сторона старается наилучшим образом оснастить себя ради выживания. Эволюционная адаптация вирусов дыхательных путей человека дает нам наглядную иллюстрацию развивающегося патогенетического процесса. Вирусы сумели развить у себя способность к успешной репликации и эффективному распространению, что вызывает эпидемические вспышки респираторных инфекций.

«Просто вирус»

Одним ранним осенним вечером родители заметили, что их трехлетняя дочка стала апатичной, вялой и плаксивой. Ближе к ночи у ребенка поднялась температура, на щечках появился нездоровый румянец; родители дали дочери парацетамол. На следующий день лихорадка сохранилась, стала нарастать заложенность носа, выделения непрерывно текли на верхнюю губу; присоединился сухой хриплый кашель, появились свистящие хрипы при дыхании. Озабоченные родители отвезли дочку к педиатру. Диагноз оказался нестрашным, но несколько неопределенным: «Это не грипп, наверное, просто вирус». Совет был таков: «Возвращайтесь домой, не обращайте внимания на кашель, уложите ее в постель и давайте больше жидкости. Если девочке станет хуже, немедленно обращайтесь». Доктор не выписал никаких лекарств. Собственно, их и не существует; нет специфического лечения, так как эту банальную симптоматику может вызвать любой из нескольких десятков вирусов, инфицирующих наши дыхательные пути. Куриный бульон работает не хуже других средств; люди моего поколения привыкли к разнообразным домашним способам. Один из них заключался в горчичных ваннах, призванных «выводить токсины». Это был такой же успешный метод лечения, как и все подобные, а терпкий вяжущий вкус горчицы отнюдь не был противным. Симптомы у девочки продержатся пару дней, а потом ребенок как ни в чем не бывало снова станет веселым и подвижным.

Так протекают почти все острые респираторные инфекции, вызываемые вирусами. Они обычно преходящи и разрешаются сами, очень редко приводя к серьезным осложнениям. Диагноз врача и его неспособность выявить конкретного виновника заболевания удовлетворительны лишь в том отношении, что точный этиологический диагноз был бы абсолютно бесполезен. Врач в этой ситуации не может предложить никакого специфического лечения. Есть совокупность разных вирусов, вызывающих простуду (не говоря о бактериях, которые вызывают сравнительно малую долю заболеваний, похожих на простуду), и в реальной обыденной жизни вас редко порадуют точным этиологическим диагнозом, если ваш ребенок заболеет острым респираторным заболеванием.

Мы все озабочены вирусами, и знакомство с ними мы начнем с исследования самого вездесущего вирусного возбудителя – вируса «простуды». К вирусам, инфицирующим нас и вызывающим симптомы банальной простуды, относят вирусы гриппа (если речь идет об очень легких случаях), вирусы парагриппа, респираторный синцитиальный вирус, метапневмовирусы, вирусы Коксаки, энтеровирусы, аденовирусы, коронавирусы и риновирусы. Тем не менее именно риновирусы вызывают классическую простуду у детей. Риновирус является ее причиной в 70 % случаев вирусной респираторной инфекции, в особенности часто риновирус поражает своих жертв весной и осенью (Jacobs, Lamson, St. George et al., 2013). Успех этого патогена самоочевиден. Но почему он так потрясающе успешен? Он вызывает преходящее острое респираторное заболевание, но наш коллективный опыт учит, что простуда распространяется в домах и школьных классах с колоссальной эффективностью. Какова та стратегия инфицирования и ее отношение к человеку (единственному хозяину риновируса), которые сделали этот вирус нашим вечным и надоедливым спутником?