Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований

2.2. Грибы

В отличие от бактерий грибы являются эукариотами. Это – гетеротрофные, одно- или многоклеточные организмы, составляющие особое царство живых организмов — Mycota.

Все грибы, за немногим исключением, имеют мицелиальное строение. Мицелий — это совокупность гифов (разветвленных нитей) гриба, из которых состоит его тело — таллом. Мицелий может быть либо одноклеточным, либо разделен перегородками (септами), т. е. многоклеточным. Грибы, имеющие слаборазвитый, несептированный мицелий, относятся к низшим. Таллом, состоящий из почкующихся или делящихся клеток, характерен для дрожжей. Дрожжи могут образовывать мицелиальные структуры, однако такой мицелий отличается от истинного, так как возникает в результате почкования, а не апикального роста гифов, и называется ложным, или псевдомицелием. Почкование присуще и некоторым мицелиальным грибам. Грибы, способные наряду с мицелием образовывать почкующиеся клетки, называются диморфными.

Клетка грибного мицелия всегда одета ригидной 4-слойной оболочкой (наружный глюкановый слой, глюкопротеидный, белковый и внутренний хитиновый). В наружных частях клеточной стенки нередко откладываются пигменты – меланины. Цитоплазматическая мембрана в качестве основных стероидов включает эргостерин и зимэстерол. Цитоплазма содержит эндоплазматическую сеть, аппарат Гольджи, митохондрии, рибосомы, лизосомы, ломосомы, вакуоли. Ядро у грибной клетки имеет четкие границы, определяемые двойной мембраной. Оно содержит ядрышко и хромосомы, которые состоят из ДНК и гистонов. Число гаплоидных хромосом у грибов никогда не бывает меньше 2 (3 – 28, а чаще 8). Грибная клетка часто бывает многоядерной.

По характеру роста мицелий грибов разделяют на субстратный (вегетативный) и воздушный (репродуктивный). Разновидностью субстратных гифов у паразитических грибов-дерматофитов являются инфекционные гифы, которые выполняют несколько функций: прикрепление к субстрату, внедрение в него (в кожу, волосы, ногти) и поглощение питательных веществ.

В отличие от растений грибы не содержат фотосинтезирующих пигментов. Этим аэробным организмам для роста требуется содержание в питательной среде углеродсодержащих и азотсодержащих компонентов, минеральных веществ, витаминов и др. Поверхностный и внутрисубстратный рост грибов обусловлен их способностью поглощать питательные вещества путем абсорбции. Развитая система гифов обеспечивает большую площадь поглощения. Оптимальная температура роста грибов составляет 28 – 30 °C (для патогенных – 37 °C и выше). Оптимум рН – 5,8 – 6,5. Однако грибы могут расти и в диапазоне температур от 0 до 60 °C.

2.3. Вирусы

Вирусы – уникальные микроорганизмы, расположенные на границе жизни, отличительными признаками которых являются обязательный паразитизм на генетическом аппарате живых клеток (растений, бактерий, насекомых, животных) и наличие в геноме нуклеиновой кислоты только одного типа. Вирусами поражены все формы жизни от растений и бактерий до человека. Способность вирусов вносить новую информацию в генетический аппарат клетки-хозяина определяет их роль как важнейшего фактора изменчивости и биологической эволюции всего живого. Наконец, с вирусами связывают возникновение опухолей, атеросклероза, диабета, разнообразных нервно-психических заболеваний и другой инфекционной патологии.

Вирусы как элементарная единица жизни – идеальный объект для молекулярных биологов и генетиков. Не случайно на вирусах сделаны величайшие биологические открытия ХХ в. – расшифровки генетического кода и механизма синтеза белка и нуклеиновых кислот. Многие опухоли животных индуцированы вирусами. В 1960-х гг. Л. А. Зильбером (1894 – 1966) впервые была выдвинута вирусогенетическая теория происхождения опухолей человека, и сейчас вирусологи активно включились в изучение их природы.

В последние десятилетия на фоне существенного снижения эпидемических бактериальных инфекций резко возрос удельный вес вирусных инфекционных заболеваний человека (до 80 % всей инфекционной заболеваемости). Грипп, аденовирусные инфекции, вирусные гепатиты и другие инфекции вирусной природы продолжают наносить большой ущерб здоровью людей. Существует немало опасных вирусов, которые могут использоваться в качестве весьма эффективного средства ведения биологической войны.

Вирусы – автономные генетические структуры, способные функциoнировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках (растений, бактерий, грибов, простейших, животных и человека), используя их генетический и белоксинтезирующий аппарат.

Дмитрий Иосифович Ивановский

Основоположником вирусологии является российский ученый, петербуржец Дмитрий Иосифович Ивановский (1864 – 1920), открывший на рубеже XIX – XX вв. уникальный мир вирусов. Еще будучи студентом, он приступил к изучению мозаичной болезни табака, которая наносила колоссальный экономический ущерб табакопроизводству. Пропуская через бактериальные фильтры Шамберлана сок из пораженных листьев, он установил, что данную болезнь вызывает мельчайший микроорганизм, который проходит через фильтр и способен вызывать заболевание при искусственном заражении. В своей диссертации (1888) он описал это заразное заболевание табака и указал, что возбудитель гораздо мельче бактерий, имеет корпускулярную природу и невидим в обычном световом микроскопе. В 1892 г. Д. И. Ивановский опубликовал материалы своих опытов, поэтому возникновение вирусологии ведет свой отсчет с этого времени.

Существует несколько гипотез происхождения вирусов.

1. Вирусы – потомки доклеточных форм жизни. Данная гипотеза основана на многообразии способов хранения генетической информации у вирусов. Различают 7 типов строения ДНК и 5 типов строения РНК-вирусов. Природа как бы отрабатывала на модели вирусов различные способы записи и сохранения генетической информации, отобрав для других живых структур наиболее надежную, двунитевую ДНК.

2. Вирусы являются результатом регрессивной эволюции одноклеточных организмов в процессе углубления паразитизма. Потомки внутриклеточных паразитировавших бактерий постепенно теряли те или иные атрибуты клетки, которые были не нужны при нахождении внутри клетки-хозяина.

3. Вирусы произошли от определенных клеточных генов, которые приобрели способность покидать клетку, но сохранили свойство относительно легко в нее возвращаться. Этой гипотезой, в частности, объясняется слабость и несвоевременность иммунного ответа организма человека на внедрение многих вирусов.

Вирусы – это форма жизни, которой присущи своеобразные атрибуты:

• способность к самовоспроизведению;

• способность передавать потомкам основные свойства – наследственность (отмечается консерватизм наследственности у возбудителя оспы и, наоборот, большая изменчивость у возбудителя гриппа и вирусов иммунодефицита человека);

• генетическая изменчивость; мутации генов вируса гриппа А происходят в миллион раз быстрее, чем в клетках, в котоклеточных рых они паразитируют; быстрому изменению подвержены поверхностные структуры вируса – гемагглютинины и нейраминидаза; иммунная система человека не успевает за этими изменениями, вот почему даже при наличии массы противогриппозных вакцин управлять данной инфекцией человек еще не научился; поверхностные структуры ВИЧ изменяются в 100 – 1000 раз быстрее, чем вирус гриппа, что осложняет создание надежных вакцин против «чумы ХХ века»;

• адаптация к определенной экологической нише, к определенному хозяину (растению, бактериям, грибам, простейшим, насекомым, земноводным, теплокровным животным и человеку); отдельные группы вирусов циркулируют со сменой хозяев, это полигостальные вирусы («рожденные» членистоногими – арбовирусы), размножающиеся в организме насекомых и животных; другие вирусы относятся к моногостальным и имеют узкий круг хозяев (бактериофаги);

• способность вызывать инфекцию, размножаться в клетке хозяина (проникает внутрь чувствительной клетки одна вирусная частица, а выходит из нее 100 – 1000 новых вирусных частиц); вирусы чаще вызывают персистентные инфекции (носительство), реже – заболевания, приводящие к гибели хозяина;

• функционирование вирусного генома по общим законам генетического кода.

Несмотря на то что вирусы относятся к представителям живого, их нельзя назвать организмами. Вирусы имеют ряд принципиальных отличий от других живых систем:

• малые размеры;

• очень простое строение вириона – геном, состоящий из ДНК или РНК, и капсид (белковая оболочка);

• отсутствие клеточного строения (цитоплазмы, мембран, рибосом);

• наличие у вируса только одного вида нуклеиновых кислот – ДНК или РНК, по этому принципу вирусы разделены на два подцарства;

• отсутствие способности к росту и бинарному делению;

• паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне, в клетку проникает только геном вируса и полностью подчиняет ее своим интересам;

• способность к интеграции собственного генома с геномом клетки;

• невозможность существовать без клетки хозяина, так как репродукция возможна только в клетке хозяина.

Размеры вирусов определяются косвенно на микрофотографиях, микрофильтрацией либо ультрацентрифугированием. Вирус, находящийся вне клетки, называется вирионом.

Фотографирование осуществляется в электронном микроскопе. Однако, в связи с тем что вирусы прозрачны для электронов, препараты готовят специальным способом. Создают подложку из чистого углерода либо коллодия, на нее наносят вирионы в испаряющейся жидкости и проводят лиофильную сушку. На материал на подложке методом напыления под углом наносят тяжелые металлы (палладий, уран). Другим способом контрастирования является метод реплик – вируссодержащий материал, очищенный от балластных белков, заливают тонким слоем пластмассы. После высыхания образуется рельефная матрица, которую просматривают в электронном микроскопе. Негативное контрастирование можно осуществить путем помещения материала на подложку и добавления нейтрального раствора фосфовольфрамовой кислоты или урацилацетата, затекающего во все углубления вириона и создающего для электронов непроницаемый фон, на котором видны детали строения вирусных частиц.

Масса вирионов определяется косвенно при ультрацентрифугировании в единицах Сведберга.

Размеры вирусов колеблются от 20 нм у самых мелких до 350 – 400 нм (у вирусов семейства Poxviridae)(1нм=10^– 9 м). Колебания размеров вирусов измеряют на микрофотографиях.

Размеры частиц можно определять при их фильтрации через заведомо известные диаметры фильтров. Крупные вирионы (тельца Пашена при оспе) можно видеть и в световой микроскоп в виде мелких точек.

Морфология вирусов учитывается при их классификации. Основной компонент вириона – белковая оболочка (капсид), содержащая нуклеиновую кислоту. Капсиды состоят из белковых субъединиц (капсомеров). Каждый капсомер – молекула белка с определенной молекулярной массой одного или разных видов белков. Например, у вируса табачной мозаики 2130 одинаковых капсомеров. Капсид включает пространство cor, у многих вирусов помимо нуклеиновой кислоты есть еще специальные ферменты. Состав белков и ферментов может быть различным: у вируса герпеса – 32 белка, у вируса оспы – 12 ферментов. Есть вирусы всего с 1 – 2 ферментами. Ферменты играют важную роль в репродукции вирусов.

По типу строения вирионов выделяют: спиральный тип симметрии (рабдовирусы, вирусы гриппа, парагриппа, коронавирусы); квазисферический – кубический, или икосаэдральный, тип симметрии; cмешанный – у Т-четных бактериофагов (головка в виде многогранника, а хвост в виде спирали).

У вируса табачной мозаики – спиральный тип симметрии вириона. Белковый чехол состоит из отдельных субъединиц в виде шестигранников. Капсомеры – белковые субъединицы, на внутренней поверхности которых расположен желобок, где находится спиралевидная РНК. Капсомеры идентичны друг другу: один и тот же белок, повторяющиеся белковые молекулы (экономится генетический материал). Диаметр капсида 15 – 18 нм, длина вириона до 300 нм (вид палочки). Капсид имеет жесткую структуру.

Тип симметрии определяется только нуклеокапсидом, суперкапсид при этом не учитывается. Например, вирус гриппа снаружи выглядит как сфера, нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии.

Икосаэдр – многогранник, состоящий из 12 вершин и 20 ребер. К данному типу симметрии относятся аденовирусы человека и животных. Капсомеры могут иметь разное строение и содержать разные белки. У аденовирусов боковые капсомеры в виде гексонов, а вершинные – пентонов (соседствуют с пятью капсомерами). От пентамеров отходят выросты (фибры). Это прикрепительные белки. Икосаэдр обеспечивает прочность капсида (защиту от внешних факторов), а прочная связь между капсомерами – минимум свободной энергии.

Многие вирусы имеют суперкапсид – дополнительную оболочку сложно устроенных вирусов, или пеплос. Структурные элементы суперкапсида – шипики, или пепломеры. У вируса гриппа их два типа: гемагглютинины и нейраминидаза; у парагриппа два комплекса – гемагглютинин и нейраминидаза вместе и второй так называемый белок слияния; у вирусов иммунодефицита человека они представлены гликопротеидами. Большинство вирусов, патогенных для человека, являются сложно устроенными. Если у вируса отсутствует суперкапсид, то это просто устроенный вирус.

У большинства сложно устроенных вирусов суперкапсид – это модифицированная (путем встраивания белков вируса) цитоплазматическая мембрана клеток хозяина. Модификация идет путем встраивания шипиков вируса в участки цитоплазматической мембраны (ЦПМ). Исключение составляют поксвирусы, у которых суперкапсид вирусоспецифический, так как имеются собственные гены, ответственные за синтез суперкапсида. Если культивировать один и тот же вирус в разных клетках, получим разные по биохимическому составу суперкапсиды. Шипы выполняют роль прикрепительных белков на поверхности чувствительных клеток. Если их удалить жирорастворителем или детергентом, вирус полностью теряет инфекционную активность.

Биохимия вирусов также хорошо изучена. В состав вириона входят: белки – 70 – 80 %; нуклеиновые кислоты – 4 – 6 % (РНК), 20 – 30 % (ДНК-вирусы); липиды и углеводы в незначительных количествах.

Вирусные белки – полипептиды, которые состоят из обычных левовращающих аминокислот, отличающихся лишь последовательностью построения. Принцип субъединичности построения капсида – повторяющиеся полипептиды небольшой величины – позволяет экономить генетический материал. Если бы капсид был построен из разных белков, требовался бы огромный геном. Так, у вируса табачной мозаики масса капсида 37,2$10⁶дальтон, а для кодирования этого капсида вирусом используется всего 600 нуклеотидов. Весь геном вируса составляет около 6000 нуклеотидов. Некоторые гены вирусов способны кодировать несколько белков со сдвигом рамки. Например, у вируса гриппа 8 генов, а кодируют они 10 вирусных белков.

Капсид за счет упорядоченности капсомеров по сравнению с простой пептидной цепью обладает меньшей свободной энергией. На уровне вирусов действует принцип саморегуляции – самосборки капсида. Принцип самосборки вирусных белков заключается в том, что при определенных условиях (рН, t°) наблюдается спонтанная сборка вирусных белков близких капсидов. При добавлении вирусных нуклеиновых кислот этот процесс упорядочивается.

В отличие от обычных у вирусных белков изменена чувствительность к протеазам. Белки вирусов выполняют защитную функцию, в том числе от нуклеаз, ультрафиолетового и ионизирующего излучений; обладают высокой, но не абсолютной устойчивостью, поскольку при репродукции необходимо «раздевание» вируса (освобождение генома). При этом изменяется чувствительность белков к протеазам. При проникновении в чувствительную клетку белки изменяются и легко гидролизуются протеазами. Вирусы проникают внутрь клетки за счет фагоцитоза вирусных частиц — виропексиса, либо слияния с клеточной мембраной.

Вирусные белки подразделяются на структурные и неструктурные. Структурные белки составляют суперкапсид, в составе сердцевины – геномные белки. Неструктурные белки не входят в состав вирусных частиц и обнаруживаются только в зараженной клетке в процессе репродукции. Это ферменты, осуществляющие функции регуляторов, и белки-регуляторы. Аминокислотная последовательность белков вирусов иная, чем у человека, поэтому их можно определять внутри клетки.

Синтез вирусных белков на рибосомах клеток идет по общим законам и регулируется информационной РНК (иРНК), которая образуется на матричных вирусных нуклеиновых кислотах. Белки вирусов выполняют защитную, адресную и регулирующие функции.

Защитная функция – это экранирование нуклеиновой кислоты вируса от химических факторов, нуклеаз и т. д., благодаря чему вирусы существуют тысячи лет.

Адресная функция состоит в проникновении только в нужную чувствительную клетку, а не в любую. Регулирующие функции выполняют внутриклеточные белки вирусов, ферменты, ферментные комплексы.

Вирусные нуклеиновые кислоты имеют существенные отличия от нуклеиновых кислот всех других существ. Обычно генетическая информация закодирована в двуспиральной ДНК и имеется однонитевая РНК (информационная, транспортная, рибосомальная). У вирусов в качестве геномной может быть как ДНК, так и РНК. У некоторых вирусов (РНК-геномных) вирионная РНК одновременно может выполнять роль информационной. Такие вирусы называют нитевыми. Если выделить в чистом виде такую РНК и поместить в клетку, то инфекция будет протекать так же, как если бы туда проник целый вирус. У других вирусов (нитевых) РНК не может выполнять функцию информационной.

Вирусы отличает многообразная структура нуклеиновых кислот. Их можно получить, разрушив вирус химическими (фенолом) или физическими (ультразвуком) факторами. Выделяют ДНК-содержащие вирусы, у которых она может присутствовать в виде: классической двунитевой (аденовирусы, герпесвирусы); двунитевой линейной с замкнутыми концами (оспа); двунитевой линейной с разрывами одной цепи (Т-фаги); с несколькими разрывами одной нити (каждый фрагмент – уникальный ген); двунитевой, замкнутой в кольцо со сверхвитками, (суперспирализация) или без них (тогавирусы); двунитевой, у которой внешняя нить замкнута в кольцо (L-нить), а у внутренней ¹/₃ отсутствует (S – нить, шорт) – гепаднавирусы; уникальной линейной однонитевой ДНК (парвовирусы); однонитевой замкнутой в кольцо (фаги).

РНК-содержащие вирусы также делятся на несколько типов: классический однонитевой линейный (пикорновирусы, тогавирусы, парамиксовирусы, рабдовирусы); линейный однонитевой фрагментированный (ортомиксовирусы); однонитевой фрагментированный, где каждый фрагмент замкнут в кольцо (буньявирусы); двунитевой с идентичными нитями (ретровирусы); двунитевой фрагментированный (реовирусы).

По химическому составу вирусные РНК и ДНК аналогичны клеточным, но в отличие от них содержат метилированный урацил.

Липиды имеют сложно устроенные вирусы, их наличие характерно для патогенных вирусов. Содержание липидов в вирусах различно: от 1,5 до 54 % (тогавирусы). Липидный состав вирусов непостоянен, у большинства это липиды клеточного происхождения. Липиды содержатся в суперкапсиде и зависят от клетки хозяина. Липидный состав различных чувствительных клеток при включении в них одного и того же вируса будет разным, тогда как одинаковые клетки при включении в них разных вирусов сохранят идентичность. Липиды выполняют важную защитную функцию, укрепляя белковый скелет суперкапсида. Они имеют вид липопротеидного или гликопротеидного комплекса. У поксвирусов синтезируются собственные липиды под контролем самого вируса, и поэтому состав липидов у них постоянен.

Углеводы входят в суперкапсид сложно устроенных вирусов преимущественно в составе различных шипов в виде моносахаридов, аминосахаридов (2 – 3 цепочки в комплексе с белковым или липидным компонентом – гликопротеидом, гликолипопротеидом). У вируса гриппа это гемагглютинин и нейраминидаза, у парагриппа – комбинированный шип гемагглютинина и нейраминидазы, у ВИЧ – поверхностные структуры gp 41- и gp 120-гликопротеиды, у вируса клещевого энцефалита – шипы гемагглютинина.

Углеводный компонент вируса определяется клеткой хозяина, укрепляет суперкапсидную структуру, придавая ей жесткость. Удаление гликопротеидных комплексов у сложно устроенных вирусов ведет к потере способности к адсорбции на чувствительных клетках. У просто устроенных вирусов углеводный компонент отсутствует.

В составе вирусов могут быть и другие компоненты. В состав полипептидов, например, часто включаются фосфаты (аденовирусы, ретровирусы, герпесвирусы, поксвирусы, ортомиксовирусы), их конкретная функция пока точно не установлена. Некоторые вирусы содержат микроэлементы: медь, молибден, а отдельные вирусы – целый набор ферментов: поксвирусы – 10, ВИЧ – 4, вирус гриппа – 3 фермента. Ферменты обеспечивают вирусную репродукцию: реакцию полимеризации (образования иРНК), репликацию (образование новых нитей нуклеиновых кислот) по принципу комплементарности. В ряде случаев ферменты синтезируются за счет генома вируса.

Вирусы также активно используют клеточные ферменты, например, у гриппа гемагглютинин находится в составе шипов в неактивном состоянии и для адсорбции на клеточном эпителии необходима протеолитическая активация гемагглютинина за счет ферментов клеточного секрета. Только после этого достигается соответствие прикрепительного белка структурам чувствительной клетки.

У ДНК-геномных вирусов ДНК-зависимая полимераза обеспечивает синтез иРНК. Благодаря ферментам происходит модификация синтезированной цепочки НК: удлинение цепи, укорочение, «подчищение» или процессинг нуклеиновых кислот – разрезание и удаление из определенных участков 1 – 2 нуклеотидов, а затем сшивание этого участка лигазой.